Kromatografi

Bir karışımda iyon veya molekül hâlinde bulunan maddeleri ayrı ayrı bölgelerde toplamak suretiyle analiz etme metodu. Bu metodun esâsı, çeşitli maddelerin bir adsorban (tutucu) tarafından farklı hızla adsorbsiyonuna (tutulmasına) dayanır. Uygun bir adsorban üzerinden bir karışım geçirilmek suretiyle karışım komponentlerine (karışımı hasıl edenlere) ayrılır.

Bu metod önceleri renkli maddelere uygulanmış olduğundan kromatografi ismini almıştır. Saf zannedilen birçok madde kromotografik analize tâbi tutulduğunda saf olmadıkları görülmüştür. Bu metodlar bugün en tesirli ayırma metodlarının başında gelir. Kimyâsal ve fiziksel özellikleri benzer olduğundan ayrılmaları çok güç olan nâdir toprak elementleri bu metodla birbirinden ayrılmışlardır. Analiz edilecek karışımın özelliklerine bağlı olarak, kromatografi farklı şekillerde uygulanır. Bugün uygulanan usuller sütun (kolon) kromatografisi, ince tabaka kromatografisi, kâğıt kromatografisi ve gaz kromatografisidir.

Sütun kromatografisi: Bir karışımda bulunan maddeleri birbirinden ayırmak ve saf olarak elde etmek için kullanılan bir usuldür. Bu usul ile çalışabilmek için araştırma laboratuvarlarında kullanılan apareyler, kromatografi sütunu (20-50 cm boyunda ve 1-3 cm çapında, dip kısmında musluk bulunan bir cam boru), çözücü deposu (bir ayırma hunisi) ve fraksiyon kabı (bir tromp erlenmayeri) olmak üzere üç kısımdan ibarettir. Bu kısımlar lastik tıpa veya zımparalanmış ağızlar (şilifler) ile birbirine bağlanmışlardır. Ayırma yapmak için önce kromatografi sütunu uygun bir adsorban (alüminyum oksit, magnezyum silikat, sellüloz, iyon değiştirici reçine vs.) ile düzgün bir şekilde doldurulur ve adsorban madde kullanılacak olan çözücü ile ıslatılır.

Sonra nümûne, çözelti hâlinde adsorban sütunun üzerine konulur. Sütun üzerine konmuş olan maddenin, adsorban içindeki hareketi bir organik çözücü veya bir çözücü karışımının sütundan devamlı olarak geçirilmesiyle temin edilir. Maddelerin sütundaki süratleri maddenin cinsine göre değişik olacağından maddeler sütunda farklı yerlerde tabakalar hâlinde toplanır. Çözücü geçirmeye devam edildiği taktirde en çok sürüklenen en önce, bunu takiben de diğerleri olmak üzere sütunun altında fraksiyonlar hâlinde toplanır. Fraksiyonlar üzerinde yapılan tâyinler ile de nümûnenin taşıdığı maddeler tesbit edilir.

İnce tabaka kromatografisi (ITK): Burada destek madde, ince bir tabaka hâlinde bir cam levha üzerine yayılmıştır. Ayırma kâbiliyetinin yüksek olması ve kısa bir müddet içinde (15-45 dakika) netice alınması gibi sebepler yüzünden son senelerde kağıt kromatografisine tercih edilmektedir.

Aparey: 25x20x10 cm ebadında, üzerinde kapak bulunan, bir cam küvetten ibarettir. Bu küvet içine bir veya birkaç kromatografi plağı dik veya eğri olarak yerleştirilmiştir. Çözücü doğrudan doğruya küvetin dibine konur. 25x20x10 cm ebadındaki bir küvet için 100 ml civarında bir çözücü kâfidir.

Kromatografi plağı: Üzeri silisyum jeli, alüminyum oksit gibi bir adsorban madde ile kaplı 20x20 veya 5x20 cm ebadında cam plaklardır. Çözücü: Organik çözücüler tek başlarına, karışımlar hâlinde veya suyla doyurulmuş olarak kullanılmaktadır. Kullanılmakta olan başlıca çözücüler, elüsyon kuvvetlerine göre şu şekilde sıralanırlar: Hekzan, benzen, kloroform, eter, etil asetat, izopropanol, etanol, metanol ve piridin. Uygun çözücüyü bulmak için tecrübeye, önce benzen veya kloroform ile başlanır. Eğer madde kâfi derecede sürüklenmez ise elüsyon kabiliyeti daha yüksek olan çözücülere geçirilir veya çözücü karışımları denenir.

Kromatografinin yapılışı: Nümûne çözeltisi, kâğıt kromatografisinde olduğu gibi plağın alt kısmına çizilmiş olan hareket hattı üzerine bir mikropitet ile konulur. Damlanın kuruması beklenir. Bir iğne ile hareket hattından 10 cm uzaklıkta mesafe işaretlenir ve plak kromatografi küvetine, hareket hattı aşağı gelmek üzere konulur. Çözücü sınırı hareket hattının 10 cm üzerindeki işarete gelince plak küvetten çıkarılır ve bir müddet açık havada tutularak kurutulur. Lekelerin yerleriUV(Uzun dalga 365 mikrometre veya kısa dalga 254 mikrometre) veya özel revelatörler kullanılarak tesbit edilir.

Ayrıca sülfürik asit, nitrik asit gibi kuvvetli asitler ve kâğıt kromatografisinde kullanılmayan diğer yakıcı maddeler de burada kullanılabilir. Basit ve kolay bir usûl de plâğa önce kesif sülfirik asit püskürtmek ve sonra bu plağı 200-250°C’de bir müddet ısıtmaktır. Bu suretle bütün organik maddeler kömürleşir ve beyaz zemin üzerinde siyah lekeler meydana gelir. İnce tabaka kromatografisi usulü ile kimyasal maddeler ve drogların saflık ve müessir madde yönünden kontrolleri yapılabildiği gibi, belirli şartlar altında elde edilen, kromatogramların özellikleri (lekelerin adeti, UV altında verdikleri renkler vs.) ne dayanılarak teşhisleri de mümkündür.

Kâğıt kromatografisi: Bir karışımda bulunan maddeleri birbirinden ayırmak ve şâhit maddeler yardımı ile teşhis etmek için kullanılan bir usûldür. Burada destek madde olarak özel şekilde hazırlanmış bir kâğıt, sürükleyici olarak da bir çözücü karışımı kullanılır. Bu karışımda esas îtibâriyle biri “duran” (genel olarak su) ve diğeri “hareketli” (organik bir çözücü) olmak üzere iki faz vardır. Hareketli faz, kâğıt üzerinde kapillarite olayına uygun olarak yürür. Organik çözücüde çok ve suda az çözünen maddeler, organik çözücüde az ve fakat suda çok çözünen maddelerden daha hızlı sürüklenirler.

Aparey: Cam kavanoz veya küvetler kullanılır. Organik faz bu apareylerin üst kısmında bulunan küvete konulur ve kâğıdın bir ucu bu küvete daldırılır.

Kâğıt: Özel olarak hazırlanmış filtre kâğıdı tipinde olan kâğıtlardır. Memleketimizde bilhassa İngiliz whatman Wo 1,2,3 kullanılır.

Kromatografinin yapılışı: Kâğıdın bir kenarına 5-6 cm mesâfeden bir çizgi çizilir. Bir mikropipet yardımıyla numune ve şâhit çözeltiler tatbik edilir. Bu sûretle hazırlanmış olan kâğıt, kromatografi apayreyine yerleştirilir ve bir ucu çözücü ile temasa getirilir. Çözücünün yükseldiği hudut, kâğıt apareyden çıkartıldıktan sonra kurşun kalemle, çizilerek belirlenir. Açık havada kurutulur. Nümûnede bulunduğu bilinen maddeler ile renk verecek reaktif püskürtülür. Etüvde kurutulur ve meydana çıkan lekeler tetkik edilir.

Gaz kromatografisi: Gaz hâlinde bulunan veya ısıtıldığı zaman bozulmadan gaz hâline geçebilen bileşiklerin teşhislerini ve birbirlerinden ayrılmasını mümkün kılan bir tekniktir. Ayırmayı yapabilmek için geniş yüzeyli bir stasyoner faz (alüminyum oksit, silikajel, aktif kömür gibi katı bir madde veya kizelgur gibi inert bir maddeyle karıştırılmış, kaynama noktası yüksek bir sıvı) ve bir mobil faz (azot, helyum gibi inert bir gaz) kullanılmaktadır. Gaz kromatografisi halen, bilhassa uçucu yağların tetkikinde kullanılmaktadır. Bu teknik ile organik asitlerin, bâzı alkaloitlerin, bâzı glikozitlerin (kardiotonik glikozitler ve saponin glikozitleri) ve bazı hormonların kontrol ve teşhisleri yapılabilmektedir.